破解Z碱基合成途径背后的故事：JACS被拒辗转见刊Science

4 月 30 日，新加坡 A*STAR /美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的赵惠民团队与天津大学张雁团队、上海科技大学 iHuman 研究所的赵素文团队合作，揭示了一个 Z 碱基（区别于 ATCG 的第五种碱基）基因组生物合成的多酶系统，相关研究论文发表在 Science 上。

图丨噬菌体基因组中二氨基嘌呤取代腺嘌呤的广泛途径

在这项研究中，研究人员解析了含 Z 碱基基因组的生物合成路径，其发现于噬菌体中，以腺嘌呤合成原料 dGTP 为起点，一步步转化为 dZTP 并被整合入基因组。此外，研究团队还发现了该噬菌体的 Z-基因组能够逃避宿主限制性内切酶的攻击。

值此之际，合成生物学竞赛组委会有幸采访了赵惠民教授。

赵惠民博士，现任美国伊利诺伊大学香槟分校化学和生物分子工程学系 Steven L. Miller 讲席教授，NSF AI 分子合成研究所所长。其于 1992 年获得中国科学技术大学生物学学士学位，后师从诺贝尔奖获得者 Frances Arnold 博士，并于 1998 年获得加州理工学院化学博士学位。

图丨赵惠民教授（来源：受访者提供）

2000 年，赵博士加入了伊利诺伊大学香槟分校并在 2008 年升任正教授。目前，赵博士主要关注合成生物学、机器学习的发展和应用，以及使用实验室自动化工具解决健康、能源和可持续性方面最严峻的挑战。

始于“机缘巧合”，成果辗转见刊

“因为一个偶然的机会，我们开始摸索 Z 碱基基因组的合成机制。”当谈及如何开始 Z 碱基基因组研究之时，赵惠民向合成生物学竞赛组委会说道。

2019 年 5 月，赵惠民教授在新加坡组织了 Biosystems Design 研讨会，彼时邀请到了史蒂夫·伯纳（Steven Benner）教授做大会特邀报告。Benner 教授是研究修饰和非天然碱基的专家，他曾与多方合作构建出由八种核苷酸组成的 DNA。

“当时，博士后魏易峰（论文的共同第一作者）和我听了报告后，对一个问题非常好奇：是否有存在天然存在的修饰碱基对呢？” 赵惠民回忆道。

实际上，早在 1977 年的 Nature 论文中，就描述了这样一种天然的修饰碱基：感染蓝细菌的噬菌体 S-2L 里存在着天然修饰的二氨基嘌呤（diaminopurine, Z）。

生命的遗传信息存储在由 A、G、C、T 四种碱基组成的 DNA 序列中，而 Z 碱基是目前唯一的例外。在由 Z、G、C、T 组成的 DNA（Z-DNA）中，Z 取代 A，与 T 配对，形成更稳定的三个氢键。

图丨Z 取代 A，与 T 配对，形成更稳定的三个氢键 （来源：Nature）

然而，四十多年过去了，关于 Z -基因组的合成机制仍然没有被清晰地阐述。

这激发了赵惠民团队的兴趣，在从事了一些生物信息学分析后，团队发现存在有一种酶—— PurZ ，其与细菌中腺嘌呤合成的关键酶 PurA（腺苷琥珀酸合成酶）同源。因此，团队提出了假设： PurZ 很可能参与了噬菌体中 Z-DNA 的合成。

几个月内，赵惠民团队合成了不同噬菌体的 PurZ 重组蛋白，并进行了生化分析。随后，赵惠民团队邀请了常年合作的天津大学张雁团队及擅长生物信息学的上海科技大学赵素文团队加入到了研究之中。

“大家一交流，都对这个问题很感兴趣，于是一拍即合。”赵惠民说道。

最终，在三方合作之下，研究人员们顺利发现 PurZ 的功能机制：其催化 dGMP （单磷酸脱氧鸟苷）、ATP（三磷酸腺苷）和 Asp（天冬氨酸）生成 2-氨基脱氧腺苷琥珀酸，然后在宿主提供的 PurB（腺苷琥珀酸裂解酶）的作用下合成 dZMP。

图丨PurZ 和 PurB 参与的 dZMP 的生物合成途径 （来源：Nature）

“这可能是运气，也可能是实验室学生的努力。我们很快就找到了多种 PurZ 同源蛋白，找到了它们催化的底物，也在体外验证了它们的活性。”赵惠民说道。

“我们最初将文章投给了 JACS，可是没有被接收。因为我们只验证了 PurZ 的体外活性，而不确定它如何在体内发挥作用。”赵惠民向合成生物学竞赛组委会透露道：“审稿人主要的质疑在于：PurZ 的 Km 值太高，而细胞内没有那么高的底物 dGMP 浓度。因此他们认为 PurZ 几乎不可能在体内工作。”

于是，团队决定进一步研究 PurZ 是如何在体内正常工作的。之后，赵素文团队在上海找到了一株被分离的不动杆菌噬菌体 SH-Ab15497，对其进行了多角度的体内实验验证。

经过一番探索，研究团队揭示了负责 Z-基因组合成的多酶体系：PurZ、PurB、GK，DUF550、dATPase 和 DNA 聚合酶。其中，PurZ，DUF550，dATPase和 DNA 聚合酶由噬菌体基因组编码，Pur B和 GK 由宿主基因组编码。

图丨噬菌体 Z-基因组的生物合成途径 （来源：Science）

赵惠民教授表示，DUF550 很关键，它是 dATP/dGTP 焦磷酸水解酶，能将宿主中存在的 dGTP 转化为 dGMP，提供了高浓度的底物。另一个关键的酶是 dATPase，它具有水解 dATP/dADP/dAMP 的活性。

不过，鉴于 DNA 聚合酶对于核苷酸没有特别的选择性，如果体系中有很多 dATP，它们仍会被整合入新合成的基因组。那么，噬菌体的基因组中是否有 A 碱基和 Z 碱基共同存在的情况呢？

在实验中，研究人员利用质谱法和纳米孔测序法展开测试研究，发现：噬菌体 DNA 中几乎不含腺嘌呤。

而在同期的一篇论文里，一个法国团队发现了一种高选择的 DNA 聚合酶 DpoZ，其会有选择性地将 dZTP，而非 dATP，加入基因组。赵惠民团队测试了很多的 DNA 聚合酶，但是没有发现类似高选择性的 DNA 聚合酶。

“这也许是我们没有进行更详细的研究，也许 DpoZ 催化整合 dZTP 的活性最高，但我们先前的工作让我们认为它可能不是必需的。“赵惠民表示道。

“在开展这些实验期间，我们也尝试了其他期刊。不过呢，他们都拒绝了我们。当然，我们得到了更丰富的数据，故事也变得越来越完整、详实。2020 年 8 月，我们决定把论文投给 Science，这一次收到了非常积极的审稿人意见。“

从被 JACS 期刊拒绝到发表到 Science 期刊上，这确实是个意想不到的曲折。

对此，赵惠民说道：“我们越挫越勇，投给了 Science。我认为这要感谢赵素文，一直以来，她都非常坚持，推动大家去解决审稿人提出的问题、去完善这项工作。 ”

与CRISPR的真核应用擦肩而过

“我的团队主要是和蛋白质打交道，这次探索 Z-基因组实属意料之外的收获。其实，做科研总是机遇和遗憾并存。”赵惠民介绍说道：“早期我们在探索用于基因编辑的蛋白质工具时，便留有遗憾，那时我们与证实 ‘CRISPR 系统能在真核细胞内完成精准切割’擦肩而过。”

在博士期间，赵惠民师从诺贝尔化学奖得主 Frances Arnold，主要从事的便是定向进化方法的开发。在 2018 年 Arnold 所获的诺贝尔奖的参考文献中，赵惠民在 5 篇关键论文中都有署名，其中有 4 篇还是第一作者。

而在成立实验室后，赵尝试将定向进化应用于与医学治疗相关的酶，比如改造用于基因编辑的蛋白质工具。

赵惠民团队是最早一批开展转录激活样效应因子核酸酶（transcriptionactivator-like effector nuclease, TALEN）相关工作的，也首次在细胞水平上用 TALEN 纠正了镰状细胞贫血症的点突变，证明了 TALEN 可以纠正遗传疾病。

TALEN 包含结合靶标DNA的转录激活子样效应物（TALE）和产生非特异性双链断裂的 FokI 核酸酶。其中，TALE 蛋白通过 33-35 氨基酸的重复结构域（repeat domain）识别一个碱基，是具备高精确性和可控性的基因编辑工具。

鉴于 TALE 组装方法耗时费力，而赵惠民团队开发出一种全自动的、快速且高通量组装 TALE 的平台-fairyTALE，并且借助此方法构建了包含 300 多个 TALE 的文库。

对此，赵惠民介绍说道：“这可谓是合成生物学的完美例子，对于任何想编辑的靶标序列， 你都可以从库里选出相应标准化、模块化的零件并组装它们。如果所有生物原件都像 TALEN 一样，那可太好了。”

图丨fairyTALE组装流程示意图（来源：ACS Synthetic Biology）

2012 年的夏天，詹妮弗·杜德纳（Jennifer Doudna）和埃马纽埃尔·沙尔庞捷（Emmanuelle Charpentier）发表的论文，发现 CRIPSR/Cas9 系统指导的精准切割。

赵惠民教授对此非常感兴趣，他给 Doudna 教授发了一封电子邮件，希望借用质粒来测试 CRISPR-Cas9 系统是否可以在真核细胞中发挥作用。

“很快，我的博士生开始着手用 CRISPR 纠正镰状细胞贫血症的突变。本来以为有 TALEN 的经验，仅仅是更换了进行切割的蛋白质，我们能很快得到结果。可是我们尝试了两个月也没有成功。”赵惠民回忆道：“考虑到博士生即将毕业，加之我也不确定这是否真的会奏效，我们就搁置了这个想法，没再继续了。”

不过在 2013 年 1 月，张锋和乔治·丘奇（George Church）的团队在 Science 发表了两篇背靠背论文，验证了 CRISPR-Cas9 系统可以对真核细胞进行精准有效的基因编辑。“唉，这是怎么回事！”一番探索后，赵惠民教授也找到了当时忽略的问题：没有使用能够顺利表达 tracrRNA 的启动子。

图丨CRISPR-Cas以及基因组编辑领域的研究进展时间线（来源：Science）

“还是蛮遗憾的。假如当时我们意识到它的重要性，再多钻研一些，可能就会去联系其它知道如何表达 RNA 的实验室了。这样我们也可以成为首批在哺乳动物细胞里实现 CRISPR 基因编辑的团队。”赵惠民说道。

“现在回想起来，做研究时发生的一切都出乎我的意料，这实在令人着迷。”

其实，从一种奇特重复序列的发现开始，再到对其生物功能特性的了解，研究人员们没有想到 CRISPR 系统竟能变成这样一个有革命性意义的基因工程技术。

赵惠民教授表示，希望将来，随着对Z-DNA乃至更多的未知遗传密码的进一步探索，这些科学发现也能展现其应用价值。

合成生物学的潜力亟待挖掘

“我们也开始挖掘 Z 碱基 DNA 的潜力，或许它很难像 CRISPR 那般爆发式地改变学界、渗入业界，但我们仍希望做出些能激发人们想象力的东西。”赵惠民说道。

研究团队发现，识别位点中含有 A 的限制性核酸内切酶无法切割 SH-Ab 15497 的基因组，这说明：Z-基因组能够帮助噬菌体逃避宿主内切酶的攻击，从而赋予噬菌体进化上的优势。而这一发现，无疑将给噬菌体疗法带来一些启示。

图 | 噬菌体侵染细菌的生命周期（来源：Europe PMC）

赵惠民认为：噬菌体疗法的一个主要限制，或者说是一个优势，在于它的种属特异性极高，只能感染特定的宿主。赵惠民团队在两年前开始设计和改造决定噬菌体特异性的尾部蛋白，以便研究人员能根据现实需求改变宿主选择性。

“也许尾部蛋白能帮助噬菌体进入细菌，但基因组 DNA 还不够稳定。所以，我们正在尝试将 Z-DNA 整合进噬菌体，使其可以对抗那些原本无法感染的细菌。”赵惠民向合成生物学竞赛组委会说道。

这项研究的奇妙之处在于，虽然合成生物学家一直在尝试扩大遗传字母表，不过现在看来，大自然本身就已经为我们提供了一套方案。

合成生物学强调“设计-构建-测试-学习（Design-Build-Test-Learn）”这一概念。研究人员在学习自然生命现象的基础上，或改造现有生物系统，或重头设计具有全新特征的人工系统；然后，利用基因合成、基因编辑等工具，对其进行表征测试，如此反复循环优化，形成了一个闭环。

图 | Design-Build-Test-Learn 示意图 （来源：Trends in biotechnology）

“使生物学技术轻松实现便捷的、可预测的工程设计，这是合成生物学的终极目标。”赵惠民教授的一大努力方向，便是将合成生物学与自动化以及机器学习相结合，来实现这一目标。

“现在正是在中国推动合成生物学社区发展的好时机。”在谈及被邀担任合成生物学竞赛评委，赵惠民这样说道：“我记得 2010 年左右，一些中国同事表示，他们缺少资金，很难开展实验。过去十余年里，国家对合成生物研究规划了诸多利好政策，极大帮助了早期合成生物学社区的建立。“

最初展露锋芒的主要是的科研机构。与外国相比，中国的企业很少自己做研发，只做制造和生产。而现在，这种情况正在快速地发生变化。

赵惠民告诉合成生物学竞赛组委会：“我们鼓励学生提出想法甚至创立公司。如果想让合成生物学真正繁荣起来，你需要产业支持。培养的学生们不可能都能成为教授，而企业可以为高素质劳动力提供出路、可以将技术真正转化为产品制造。这让合成生物领域的创新想法有落地的可能，同时以产业需求驱动源头创新。“

赵惠民教授认为：合成生物学竞赛联合多方合成生物领域相关的高校、企业、资本、媒体等等，正是在助推这样一件非常重要的事。