在家里检测新冠病毒

凌辉先生毕业于原解放军第一军医大学，新加坡国立大学药学博士，美国MD安德森癌症中心博士后。曾任MD安德森癌症中心助理教授，现于波士顿的诺华制药公司生物医药研究所担任主任科学家。他最近开始写一些跟新冠病毒有关的科普随笔，授权在我的微信公号发表，欢迎大家多多转发。

严锋

新冠病毒剖面图

5月6日，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了Sherlock Biosciences（夏洛克生物科技公司）开发的新冠病毒CRISPR检测试剂盒的紧急使用许可。虽然只是最近美国批准的60多种用于紧急用途的新冠病毒测试的其中之一，但这一批准引起了广泛关注。因为这种检验方法使用了当今最热门的基因编辑CRISPR技术，是第一个获FDA批准的CRISPR应用，标志着 CRISPR从研发到临床应用的突破。

噬菌体病毒入侵细菌

什么是CRISPR呢？CRISPR是一个英文缩写,其大意是指细菌体内的一串特征性的DNA序列。和所有的生物一样，细菌也有天敌，经常受到病毒的骚扰，尤其是一类长相奇特如外星人的名叫噬菌体的病毒。噬菌体病毒侵袭细菌的过程有些像蚊子叮人，不同的是它不吸血，只是把自己的遗传物质DNA注入到细菌内。病毒的DNA可以整合到细菌的DNA里，利用细菌的细胞工具复制组装，组装好的子病毒再以裂解细菌的方式释放出来。细菌只是单细胞生物，没有免疫细胞，那么它们怎么抵抗病毒的入侵呢？CRISPR就是细菌进化出来的抵抗病毒入侵的免疫机制。简单来说，遭受病毒入侵时, 细菌会把入侵病毒的DNA序列的片段抄进细菌的CRISPR DNA序列中，以而产生对病毒的“记忆”。当病毒再次入侵时，细菌的CRISPR DNA“记忆”信息和另外一些固定序列信息转录为向导RNA。向导RNA和一种叫 Cas9的蛋白结合成神奇的蛋白-RNA复合体：向导RNA负责寻找DNA上跟它一样的序列，把复合体带到特定的DNA位置，Cas9负责“剪切”掉特定位置的DNA，从而使病毒失活。在这个有趣的系统里，RNA是找到目标的“向导”，蛋白Cas9是切断DNA的剪刀，二者缺一不可。

CRISPR剪切DNA

生命的奥秘写在ACGT这四种碱基组成的独特DNA序列之中。人类DNA基因组含有30亿个碱基对，经过各种缠绕扭曲藏在小小的细胞核内。虽然人类基因组序列已经破译，但从30亿碱基序列中对某一特定位置进行精确编辑，还是个巨大的挑战。这种细菌体内简单高效的靶向DNA编辑功能给科学界带来了重大启示！虽然人体没有相似的CRISPR编辑系统，但是可以利用细菌产生的Cas9蛋白，和人工合成的向导RNA来组成一种精准的基因编辑工具。通过改变向导RNA的碱基序列，就能让CRISPR的DNA编辑位点随之而变。CRISPR剪切后的DNA，会通过机体的修复机制在编辑位点形成不同的碱基序列，从而改变基因的活性和功能。这种简单高效的基因编辑工具很快得到了广泛的关注，CRISPR的编辑效率和准确度也由于大量的研发而不断提高。

RNA报告分子切割后发出的荧光

读者也许会问，基因编辑技术用来改变DNA序列，这不是跟治疗相关吗？怎么能用来检测新冠病毒呢？没错，很多生物医药界CRISPR的研发都是针对治疗的，如现已处于临床试验阶段的镰刀型细胞贫血病的基因编辑疗法。检测新冠病毒用的是另类的基因编辑技术。如前所说，RNA只是向导，蛋白Cas9才是切断DNA的剪刀。细菌不仅有Cas9，还有各种其他编号的Cas蛋白。与Cas9 “剪切”DNA不同，Cas13是“剪切”RNA的。Cas13还有一个疯狂特性，就是在“剪切”靶向RNA之后，顺便切割其他的非靶向RNA（专业术语叫附带切割）。也就是说，一旦遇到目标，它会不分青红皂白，切割反应体系内所有的RNA。如何探测出Cas13是否成功进行了RNA切割呢？如果在反应体系里加入特殊合成的、带有荧光标记的RNA报告分子，切割后的报告分子会发出特征性的荧光，这样就可以通过荧光分析仪区分出反应体系内的切割状况。

SherlockBioscience公司的新冠病毒CRISPR检测试剂盒就是应用了Cas13。该公司由麻省理工学院华人科学家张锋与他人合作创办，以虚构侦探夏洛克×福尔摩斯（Sherlock Holmes）命名，意为在蛛丝马迹中寻找病毒存在的证据。

新冠病毒是一种含有3万个碱基的单链RNA病毒。研究人员设计了两种识别新冠病毒特征的向导RNA，与Cas13蛋白结合起来，它们就形成了能够检测新冠病毒RNA是否存在的CRISPR系统。不包含从鼻、口、喉拭子或肺部液体中提取RNA的程序，这个试剂盒的检测过程大约一小时，共有两个步骤。第一步是将提取出的RNA反转录成DNA，再等温扩增DNA（与常规PCR扩增方法相比，等温扩增方法不需要特殊仪器，而且可缩短反应时间）。这个反应需在61°C进行，用时40分钟。第二步是把扩增的DNA转录成RNA，看是否能激活Cas13反应体系的附带切割效应，用荧光板分析仪来量化切割报告分子产生的荧光。第二步反应需在37°C进行，用时10 分钟。为什么要把RNA转成DNA、再转回RNA呢？这主要是因为试验用品的限制，用于扩增的酶只能作用于DNA，而Cas13又只能切割RNA。Sherlock Bioscience公司的CEO称申请FDA批准过程中，做了2000多个测试，试剂盒的灵敏度和特异性都达到100%。不过这一高准确率还有待进一步的临床验证。

研发中的试纸测试法

目前，这种新冠试剂盒只能在经认证的实验室里使用，这限制了该检测产品的应用范围。公司CEO表示，团队正在研发可直接在家中使用的、类似于早孕试纸的试剂盒。据张锋在5月中旬的美国基因与细胞治疗学会年会上透露，这一新的检测盒可使所有的化学反应在同个温度下进行，大大缩短检测时间，而且无需荧光检测仪等特殊仪器，高效方便，可在家中自行检测。一旦问世，它将会是检测新冠病毒的、名符其实的“神探福尔摩斯”。

2020年5月18日于波士顿