Immunity | 上海药物所郑杰团队揭示K63-polyUb介导的MDA5-MAVS抗病毒信号通路组装程序与激活机制

MDA5是细胞内的异体RNA监测蛋白，属于RIG-I样受体家族（RLRs）的重要成员。MDA5主要参与调控冠状病毒、小核糖核酸病毒、黄病毒和丁型肝炎病毒等RNA病毒引起的免疫反应，是天然免疫的一道重要屏障。MDA5在自身免疫疾病中可识别内源性alu RNA和未经ADAR编辑过的,以及线粒体释放出来的双链RNA。RLRs家族共有RIG-I、MDA5及LGP2三个成员，其中RIG-I和MDA5的N端均拥有串联CARDs结构域。CARDs属于死亡结构域（Death Domain）超家族，可通过CARD-CARD同型相互作用招募MAVS，最终促进I型干扰素（IFN）通路的激活。

泛素化是真核生物中一种重要的翻译后修饰。泛素化可由E1、E2和E3酶及DUBs可逆调节。泛素可以被同型泛素分子修饰并组装成多聚泛素链，包括M1、K11、K27、K48及K63等不同连接的多聚泛素链。其中，K63连接的多聚泛素链（K63-polyUb）在调节RLRs信号通路中起着关键作用[1]。

前期研究发现，短链K63-polyUb可以通过共价锚定和非共价锚定两种方式有效地促使RIG-ICARDs的寡聚[2,3]。形成的异源四聚体复合物（K63-polyUb-RIG-ICARDs）可激活MAVSCARD寡聚，形成MAVS纤维的核心[2,3]。

然而，K63-polyUb是如何调控MDA5 CARDs组装以及招募、激活MAVS CARD的分子机制，仍是待解决的科学问题。尽管K63-polyUb是MDA5介导的MAVS激活所需要的[4]，但目前尚未发现被K63-polyUb共价修饰的MDA5 CARDs。这暗示着非锚定的K63-polyUb在MDA5-MAVS信号传递中的重要作用。

2021年10月12日，中国科学院上海药物研究所郑杰团队在Immunity杂志上以Research Article形式在线发表了题为“Ordered assembly of the cytosolic RNA-sensing MDA5-MAVS signaling complex via binding to unanchored K63-linked poly-ubiquitin chains”的研究成果，揭示了长链、非锚定K63-polyUb促进MDA5-MAVS组装程序与信号传递的分子机制。

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首先，研究人员建立了K63-，K48-连接泛素链的生化合成平台，并制备了不同长度的K63-polyUbn（2≤n≤14）（图1）。通过氢氘交换质谱技术（Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry，HDX-MS），研究人员发现MDA5CARDs和RIG-ICARDs的氢氘交换保护程度依赖于不同长度的K63-polyUbn（MDA5: n≥8; RIG-I: n≥3）而不依赖于K48-polyUbn（n≥10）；并且保护强度随着K63-polyUb的长度增加而特异性加强。

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图1：HDX-MS分析K63-polyUb（2≤n≤14）对RLR CARDs寡聚的影响

为了研究K63-polyUbn介导的MDA5CARDs寡聚体的组装机制，研究人员利用冷冻电镜首次解析得到了分辨率为3.3Å的MDA5CARDs与K63-polyUb13复合体的结构。这也是MDA5CARDs第一个近原子分辨率的冷冻电镜结构。八个Ub分子包围着一个左手螺旋的、环状的CARDs四聚体，其中包括五个Ub-CARD独特的互作界面和七个CARD1-2分子内和分子间独特的互作界面（Ia:Ib，IIa:IIb，和IIIa:IIIb）（图2）。

那么，MDA5CARDs-K63-polyUbn异源四聚体又是如何招募其下游信号蛋白MAVS？

研究人员进一步通过Cryo-EM解析得到了分辨率为3.2Å的由长链K63-polyUb11拴系的“自下而上”的左手螺旋MDA5CARDs-MAVSCARD复合体，MAVSCARD四聚体通过MDA5CARD2-MAVSCARD同型互作的方式堆叠在由八个Ub分子拴绳的MDA5CARDs四聚体顶部。MDA5CARD2与MAVSCARD表位包括三个独特的分子间同型界面（Ia:Ib，IIa:IIb，和IIIa:IIIb）。互作界面氨基酸位点的突变会导致细胞内IFN信号通路激活的缺陷。

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图2：单颗粒冷冻电镜显示K63-polyUbn（n≥8）介导的MDA5-MAVS CARD-CARD的组装机制

同时，研究人员通过生物大分子氢氘交换质谱技术，首次证明了人类MDA5全长蛋白的CARDs在初始状态下处于张开的构象并可与长链K63-polyUb10结合。然而在早期研究中，氢氘交换质谱已经证明了RIG-ICARDs在初始状态下呈闭合的构象[5,6]。这也直接证明了RIG-I和MDA5的CARDs在溶液状态下构象上的巨大差异。

其次，研究人员进一步发现K63-polyUb10拴系的MDA5CARDs复合物在溶液中的稳定性受MDA5的RNA依赖的ATP酶活性别构调节：受RNA刺激的MDA5可以结合并水解ATP，其结合产生的能量可以远程地稳定K63-polyUb10-MDA5CARDs的组装以持续传递下游激活信号；相反，未受RNA刺激的MDA5虽然也可以与长链K63-polyUb10结合，但ATP可以使其解聚并防止MDA5不必要的激活（图3）。

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图3：HDX-MS分析全长MDA5在其识别配体或底物作用下（dsRNA/ATP/K63-polyUb）的动态的构象变化与信号传导机制

这些证据表明，在含有高浓度ATP的线粒体膜附近，MDA5对RNA的有效识别有助于远程调控K63-polyUb10-MDA5CARDs复合体的稳定性，并帮助激活MAVS。

综上所述，该研究通过生物大分子氢氘交换质谱和冷冻电镜技术发现长链，非锚定K63-polyUb类似于一个“分子桥梁”，促进了MDA5CARDs四聚体的组装，使之形成一个激动状态的构象来招募下游MAVSCARD，以进一步促进MAVSCARD的寡聚和激活（图3）。激活状态下的MDA5可以结合并水解ATP，远程提升CARDs-K63-polyUb10的稳定性以持续激活MAVS。

该研究弥补了MDA5通路激活与信号传导研究的空白，进一步揭示了长链，非锚定K63-polyUb在细胞内作为内源性激动剂的免疫学功能，为理解泛素分子多样性在抗RNA病毒天然免疫信号传导与调控中的作用提供了新的线索。

上海药物所博士后宋斌和美国NIH Research Associate陈运为论文第一作者，上海药物所郑杰研究员为论文的通讯作者。该工作得到了新加坡南洋理工大学罗大海教授、吴彬教授，美国Scripps研究所Patrick Griffin教授，上海药物所罗成研究员和张乃霞研究员的大力支持，得到了国家自然科学基金、上海市浦江人才计划等项目的支持。

全文链接

https://www.cell.com/immunity/fulltext/S1074-7613(21)00393-9

参考文献

1、Hu, H. and S.C. Sun, Ubiquitin signaling in immune responses. Cell Res, 2016. 26(4): p. 457-83.

2、Zeng, W., et al., Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell, 2010. 141(2): p. 315-30.

3、Peisley, A., et al., Structural basis for ubiquitin-mediated antiviral signal activation by RIG-I. Nature, 2014. 509(7498): p. 110-4.

4、Jiang, X., et al., Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response. Immunity, 2012. 36(6): p. 959-73.

5、Zheng, J., et al., High-resolution HDX-MS reveals distinct mechanisms of RNA recognition and activation by RIG-I and MDA5. Nucleic Acids Res, 2015. 43(2): p. 1216-30.

6、Zheng, J., et al., HDX-MS reveals dysregulated checkpoints that compromise discrimination against self RNA during RIG-I mediated autoimmunity. Nat Commun, 2018. 9(1): p. 5366.