专家点评Nature——刘兵/兰雨/Ginhoux解析人源巨噬细胞胚胎起源

点评丨温子龙（香港科技大学）、徐进（华南理工大学）

责编丨兮

巨噬细胞（Macrophages）作为一种经典的固有免疫细胞，通过吞噬和抗原提呈作用构成了人体复杂免疫系统的基石，尤其组织驻留型巨噬细胞更是机体固有免疫屏障的核心组件之一。除了为人熟知的免疫功能，巨噬细胞也发挥着一些重要的非免疫作用，如参与胆红素代谢、肝素清除、铁贮积及血浆蛋白合成等。在胚胎早期，巨噬细胞还参与了卵黄囊脂质代谢、造血微环境形成、骨和神经系统发育等，它们的功能不可或缺。

对于成体而言，尽管位于造血系统层级顶端的造血干细胞可以分化为所有类型的血液和免疫细胞，但新近研究发现，小鼠部分组织驻留型巨噬细胞起源于造血干细胞出现之前（即非造血干细胞来源），并且能够通过自我更新稳定持续地存在。在哺乳动物胚胎发育过程中，巨噬细胞是最早出现的免疫细胞，它们在胚外卵黄囊中发育分化，并在血液循环的驱动和趋化因子的诱导下精准定位至胚内各个靶器官形成组织驻留型巨噬细胞【1】。例如，小鼠头部的小胶质细胞就是这些卵黄囊中的原始巨噬细胞迁移至脑部并特化形成的，而表皮Langerhans细胞、肝脏Kupffer细胞等则起源于卵黄囊中产生的红髓祖细胞（erythro-myeloid progenitor, EMP）迁移至胎肝进一步分化形成的单核细胞【2】（图1）。

图1. 小鼠胚胎期组织驻留型巨噬细胞起源

相较于小鼠，人胚早期巨噬细胞发生和特化的研究一直以来受到技术手段的极大限制。人巨噬细胞的细胞起源是否与小鼠类似？其发育及特化的动力学演进如何？人组织驻留型巨噬细胞特化过程的分子基础是什么？这些关键科学问题的答案仍不清楚。近年来快速发展的单细胞组学技术为精细解析这些数量稀少且转瞬即逝的发育细胞群体带来机遇。

2020年5月20日，中国人民解放军总医院第五医学中心刘兵研究组、暨南大学基础医学院兰雨研究组、新加坡免疫协作组（Singapore Immunology Network）/上海市免疫学研究所Florent Ginhoux研究组合作在Nature杂志在线发表了题为Deciphering Human Macrophage Development at Single-Cell Resolution的研究论文。该研究利用单细胞转录组测序技术精准解析了人胚期（孕8周内）巨噬细胞发育过程：明确了人胚巨噬细胞的多重起源；结合转录组、免疫表型和功能三个层面定义了人胚第一个具有多系分化潜能的造血祖细胞群体（YSMP）；解析了组织驻留型巨噬细胞特化过程中的关键分子特征。这是国内研究者应用单细胞转录组测序技术继2019年先后解析人胚造血干细胞发生【3】（详见BioArt报道：专家点评Cell Res | 刘兵/兰雨团队解密人类造血干细胞起源）和T淋巴细胞发育【4】（详见BioArt报道：专家点评Immunity | 胡洪波/刘兵/兰雨团队单细胞精度解析人类T淋巴细胞起源及胸腺器官发生）以来，又一项在人胚造血发育研究的重要贡献。

1. 人胚造血全景图谱及YSMP的鉴定

作者首先对人胚多位点（卵黄囊、头、肝、循环血、皮肤、肺）沿发育轴进行定期间隔取样，使用改良的STRT-seq测序【5】构建了人胚早期CD45+造血细胞的单细胞转录组图谱，共识别15个造血群体，包括8个具有（干）祖细胞特征的群体和7个分化的血液细胞群体（图2a-b），并揭示上述群体在不同造血位点（卵黄囊、胚肝等）的发育动力学特征（图2c）。其中卵黄囊来源的髓系偏向祖细胞（yolk sac-derived myeloid-biased progenitor, YSMP）是最早捕获的造血祖细胞群体，通过转录组比对，发现其相较于具有类似时空动力学和祖细胞特征的小鼠EMP，红系特征明显减弱（图2d）；通过计算筛选预测的YSMP免疫表型（CD45+CD34+CD44+）结合体外单细胞功能实验，证实了其髓系偏向的多系分化潜能造血祖细胞的身份（图2e）。YSMP的鉴定为人胚卵黄囊造血发育以及巨噬细胞卵黄囊起源的深入研究奠定了基础。

图2. 人胚早期CD45+造血细胞的单细胞转录组图谱构建及YSMP鉴定。

图2. a：入组标本；b：UMAP展示人胚期造血细胞群体；c：不同造血群体在卵黄囊（YS）和胚肝（liver）中的动力学构成；d：人YSMP与小鼠EMP红系与髓系特征基因表达对比；e：YSMP体外分化潜能构成。

2. YSMP在胚肝中的发育路径解析

肝脏是胚胎期持续时间最长的造血位点（约从人胚第4周至胎儿出生）。而在造血干细胞出现以前，YSMP是肝脏造血的重要祖细胞来源，但其在肝脏的分化和发育路径尚不清楚。作者对于人胚肝脏早期造血祖细胞群体的分析显示，最早进入肝脏的祖细胞群体YSMP 随后分别向单核细胞和粒系特征两个方向进行特化，而且后者的发育较前者相对滞后。这是首次揭示了人胚中肝脏非造血干细胞依赖的髓系造血发育过程（图3）。

图3. 胚肝非造血干细胞依赖的髓系造血分化路径。

图3. a-b：Monocle展示YSMP单核及粒系双分化路径的拟时序（a）和对应细胞所属的群体（b）；图c：热图展示YSMP在单核及粒系分化路径上的特征基因表达。

3. 人胚巨噬细胞的多重起源

作者接下来重点分析了与巨噬细胞发育相关的所有髓系群体，鉴定出10个具有不同转录组特征的巨噬细胞亚群，表明巨噬细胞在人胚阶段已经出现了显著的器官异质性（图4a）。进一步结合细胞获取的真实发育阶段，发现人胚中非造血干细胞依赖的巨噬细胞存在两波起源：第一波是卵黄囊原位分化的原始巨噬细胞；第二波是卵黄囊的YSMP迁移至肝脏经由单核细胞进一步分化形成的巨噬细胞（图4b）。这两个卵黄囊来源的巨噬细胞发育路径与既往小鼠中的发现高度相似，表明巨噬细胞发育的物种保守性。

图4. 人胚期巨噬细胞亚群及其起源。a：UMAP展示人胚期髓系相关造血群体；b：非HSC依赖的巨噬细胞双起源。

4. 小胶质细胞的起源和特化

对于小胶质细胞的起源和特化路径的分析发现，头部中巨噬细胞具有明显的发育阶段异质性，特征基因的表达证实了其连续的特化过程（图5）。该结果还进一步揭示了小胶质细胞特化的关键时间节点：CS 11（约受孕后24天）已可以检测到卵黄囊迁移至人胚头部的原始巨噬细胞；CS 15（约受孕后34天）部分头部巨噬细胞开始出现小胶质细胞分子特征（SALL1基因）；CS 17（约受孕后41天）以后伴随着C3、P2RY12等标志性基因表达，头部巨噬细胞逐渐特化为典型的小胶质细胞。

图5. 小胶质细胞的起源和特化。a：UMAP头部巨噬细胞群体；b：巨噬细胞及小胶质细胞相关基因表达。

5. 人胚器官特异性巨噬细胞分子特征解析

最后，作者通过比较胚期器官特异性巨噬细胞与成体经典组织驻留型巨噬细胞的转录组特征发现：人胚期特化最显著的为头部小胶质细胞和肝脏Kupffer细胞；部分皮肤巨噬细胞在人胚期已开始出现Langerhans细胞分子特征；人胚期结束时肺部巨噬细胞尚未开始特化（图6a-b）。作者通过差异表达基因分析，找到了不同组织驻留型巨噬细胞的特征基因，为巨噬细胞的亚群认定提供了参考和依据（图6c）。

图6. 人胚期与成体组织驻留型巨噬细胞。

图6. a-b：UMAP展示胚期与成体巨噬细胞数据合并后重新分群结果的原始群体（a）和新鉴定群体（b）；c：热图展示b图中各类组织驻留型巨噬细胞及胚期未特化巨噬细胞间差异基因。

综上所述，本研究通过高精度的单细胞转录组测序，绘制了人胚期造血细胞发育图谱，揭示了人胚发育中非造血干细胞来源的早期髓系祖细胞YSMP的转录组和功能特征，解析了巨噬细胞尤其是小胶质细胞的起源和特化过程。这些发现将为人胚造血发育和固有免疫系统形成的规律及调控研究、以及巨噬细胞相关疾病的发病和病理生理机制研究提供重要的理论基础和数据库资源。

据悉，刘兵、兰雨和Florent Ginhoux为该论文的通讯作者。博士后边志磊，博士研究生公彦栋、黄涛、Christopher Z. W. Lee、柏志杰、施卉，及卞丽红主任医师为该论文的第一作者。首都医科大学附属北京儿童医院张蕊主任医师团队参与了项目协作。

另：暨南大学兰雨课题组长期招聘博士后（待遇：20 - 35万/年，房补2000元/月）！该课题组长期致力于血管与血液系统发育研究，科学发现发表在Nature、Cell Stem Cell、Immunity、Cell Research等杂志。欢迎血液、免疫或生信分析相关方向优秀博士或博士研究生联系咨询！联系人：兰雨；邮箱：[email protected]。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41586-020-2316-7

专家点评

温子龙（香港科技大学生命科学部）、徐进（华南理工大学医学院）

巨噬细胞是人体免疫系统的重要组成细胞，传统观念认为巨噬细胞的主要功能是吞噬并清除入侵的病原体以及死亡的细胞，发挥身体清道夫的功能。近些年的研究提示巨噬细胞的功能远比最初的认知复杂，它可以促进组织发育，维持组织动态平衡，影响组织再生，调控神经活性和网络组成。巨噬细胞功能的失调与癌症、糖尿病及神经退行性疾病等多种疾病密切相关。

巨噬细胞属于血液系统的一员，小鼠中血液系统发育首先在胚胎卵黄囊产生原始造血巨噬细胞以及红细胞，继而在卵黄囊产生红系髓系前体细胞（erythromyeloid precursor，EMP），然后才会在小鼠躯体等部位产生造血干细胞。长期以来，成体小鼠中巨噬细胞一直被认为来源于造血干细胞，近些年的研究却发现相当一部分成体组织器官中的驻留巨噬细胞，例如中枢神经系统的小胶质细胞（microglia）、皮肤表皮的朗格汉斯细胞（Langerhans cell）、肝脏中的库普弗细胞（Kupffer cell）等，来源于原始造血巨噬细胞或EMP【6-8】 。这些非造血干细胞来源的巨噬细胞在基因调控以及功能等方面与造血干细胞来源的巨噬细胞不尽相同，促使我们思考这两种不同来源的巨噬细胞各自在疾病中发挥的作用。

尽管传统观念认为哺乳类动物血液系统发育是非常保守的，但人体中是否如小鼠一样，存在非造血干细胞来源的组织驻留巨噬细胞尚缺乏明确证据。理清人体中巨噬细胞的谱系关系，阐明不同谱系来源的巨噬细胞功能的异同，将有助于开发治疗重大疾病的新方法。受实验材料、方法等多方面的限制，对人体中巨噬细胞的研究长期局限于较为简单的显微镜观察或体外培养实验，无法有效应对体内多重来源的巨噬细胞之间错综复杂的关系。近年来，解放军总医院第五医学中心刘兵研究组与暨南大学基础医学院兰雨研究组合作建立了先进的高通量测序分析技术平台，并利用一系列先进的单细胞测序和分析技术在人类造血干细胞和T细胞发育研究领域取得了突出的成果【9, 10】 。近日，他们又和新加坡科技研究局的巨噬细胞研究专家Florent Ginhoux合作在人类巨噬细胞的发育研究领域取得重要发现，三个课题组共同在Nature杂志发表题为Deciphering human macrophage development at single-cell resolution的论文。

在该项研究中，作者利用高深度单细胞转录组测序以及体外培养验证等技术方法对巨噬细胞在人类胚胎不同阶段、不同组织中的发育进行了精细的研究。作者发现，与小鼠中组织驻留巨噬细胞来源于原始造血巨噬细胞或EMP类似，人体胚胎组织驻留巨噬细胞存在两种非造血干细胞起源，分别是原始造血巨噬细胞和CD45+CD34+CD44+人体卵黄囊髓样偏向性前体细胞(yolk-sac-derived myeloid-biased progenitors，YSMP),其中YSMP可能是小鼠中EMP在人体的对应细胞。进一步对人体胚胎巨噬细胞的发育轨迹分析发现原始造血来源的巨噬细胞于人体胚胎发育CS11阶段(怀孕后4周，类似于小鼠胚胎发育第8.5-9.0天)首先出现，由YSMP分化生成的单核细胞源性的巨噬细胞则到CS17阶段 (怀孕后6周，类似于小鼠胚胎发育第12.0-12.5天) 后才出现。作者接下来聚焦于脑部驻留巨噬细胞——小胶质细胞在人体胚胎期的发育，作者发现CS11–CS23（怀孕后4-8周）阶段头部的巨噬细胞展现出由原始造血巨噬细胞向小胶质细胞连续发育的特征，而YSMP来源的单核细胞在头部占比极少，提示人体胚胎期小胶质细胞主要来源于原始造血的巨噬细胞。进一步基因表达谱分析显示，免疫相关基因的表达水平随着头部巨噬细胞的发育逐渐下降，而组织、神经发育相关基因的表达水平则随之上升，这一过程与小鼠小胶质细胞的发育类似。对胚胎期、儿童期和成体期的数据做比较后发现，头部、肝脏中驻留巨噬细胞的特化在胚胎期已经发生，而皮肤、肺中驻留巨噬细胞的特化程度较轻甚至没有特化。

该研究跨越人体胚胎的多个发育阶段，覆盖多个组织器官，是目前为止对人体胚胎巨噬细胞发育最系统完整的研究。且该研究通过胚胎样本获得的在体实验数据相比体外实验数据更真实可靠，为相关领域的研究提供了目前最翔实可靠的人体胚胎巨噬细胞单细胞转录组数据。该研究的结果表明人体胚胎巨噬细胞的发育与小鼠中的情况非常类似，为小鼠巨噬细胞研究结果向人体医疗转化提供了依据。作为一个里程碑式的工作，该研究为将来人体巨噬细胞的研究奠定了坚实的基础。

制版人：珂

参考文献

1. Wynn, T. A., Chawla, A. & Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature 496, 445-455, doi:10.1038/nature12034 (2013).

2. Hoeffel, G. et al. C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages. Immunity 42, 665-678, doi:10.1016/j.immuni.2015.03.011 (2015).

3. Zeng, Y. et al. Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing. Cell research 29, 881-894, doi:10.1038/s41422-019-0228-6 (2019).

4. Zeng, Y. et al. Single-Cell RNA Sequencing Resolves Spatiotemporal Development of Pre-thymic Lymphoid Progenitors and Thymus Organogenesis in Human Embryos. Immunity 51, 930-948 e936, doi:10.1016/j.immuni.2019.09.008 (2019).

5. Li, L. et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis Maps Development of Human Germline Cells and Gonadal Niche Interactions. Cell stem cell 20, 858-873 e854, doi:10.1016/j.stem.2017.03.007 (2017).

6. Ginhoux, F. & Guilliams, M. Tissue-Resident Macrophage Ontogeny and Homeostasis. Immunity 44, 439-449 (2016).

7. Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F. & Gomez Perdiguero, E. Development and function of tissue resident macrophages in mice. Seminars in Immunology 27, 369-378 (2015).

8. Perdiguero, E. G. & Geissmann, F. The development and maintenance of resident macrophages. Nat Immunol 17, 2-8 (2015).

9. Zeng, Y. et al. Single-Cell RNA Sequencing Resolves Spatiotemporal Development of Pre-thymic Lymphoid Progenitors and Thymus Organogenesis in Human Embryos. Immunity 51, 930-948 e936 (2019).

10. Zeng, Y. et al. Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing. Cell Res 29, 881-894 (2019).