新冠COVID-19: 病毒学、免疫学和病理学（上）

作者/Clifford Lowell教授

4月2号，加州大学旧金山分院（UCSF）实验室医学系主任Clifford Lowell教授在ImmunoX Initiative 俱乐部活动做了一个讲座，从病毒学、免疫学和人病理学方面对新冠做了个全面分析。

主持人：什么是Bakar ImmunoX Initiative？这是UCSF一项大胆而一流的研究项目，企图用社会工程、一流技术、基础设施和独特的数据分享模型来支持免疫科研人员和临床医生的工作。详情请看: http://ImmunoX.ucsf.edu 。自从COVID-19爆发以来，很少有人从病毒学、免疫学和病理学角度对新冠进行过系统解释。现在有请Clifford Lowell 教授。

Figure2 Lowell教授的讲座幻灯片首页

Lowell教授：谢谢主持人。本讲座试图从医学院水平从病毒学、免疫学和病理学角度对新冠做的概要性的介绍。

先来介绍一些参考资料链接，包括新冠跟踪系统。

第一个是霍普金斯大学的链接，跟踪全球感染和死亡人数等等。（https://coronavirus.jhu.edu/map.html）

Figure 3 霍普金斯大学新冠跟踪系统，数据截止4月2日

另一个不错的跟踪系统，可以实时跟踪美国每个州、每个县的数据。(https://www.statnews.com/feature/coronavirus/covid-19-tracker/?utm_campaign=cv_landing）

在讲座开始之前，让我们先来弄清些基本概念：

新冠病毒叫：SARS-CoV-2，而因感染该病毒所引起的疾病叫COVID-19，多数人两者不分，但不应该将两者混淆。

什么是冠状病毒？它是一种ssRNA（single strandRNA，即单链RNA）病毒，是种带包膜(enveloped)的正链（plus strand）病毒，其基因组大约有3万个碱基对，是一种最大的RNA病毒。该病毒表面覆盖着许多刺状蛋白，这是该病毒最主要的能量决定因素（energetic determinants），也是与人体细胞受体结合的部分。

Figure 4 新冠病毒SARS-CoV-2

先介绍一下冠状病毒基础知识。自然界广泛存在三类冠状病毒：α，β和γ，它们主要感染禽类和哺乳动物。我们知道有4种感染人体的冠状病毒，包括hCoV-229E、NL63、OC43和HKU-1，其中前两者是alpha型的，后两者是beta型的。这些病毒自1960年代之后就被发现确认，都会引起普通上呼吸道感染（URI），流行率约为15%，70%的人群被感染过，目前许多人已经带有抗体。

近二十年出现了一些新型致病病毒，包括2002年在新加坡和多伦多等地爆发的萨斯病毒 SARS-CoV，2012年在中东等地爆发的MERS病毒，和目前正在流行的SARS-CoV-2新冠病毒。SARS和MERS都属于beta型病毒。SARS 造成8000人感染，致死率约10%，现在已经基本灭绝，过去10年中没有新爆发。MERDS造成2000人感染，致死率约35%，仍在中东和亚洲各地零星流行。

我们来看看新冠病毒的基因组结构。

Figure 5 SARS、CoVZC45和新冠病毒的基因组结构， Wu et al 2020 Nature

上图第一个是正在流行的新冠病毒SARS-COV-2的基因组结构，第二个是与蝙蝠相关的冠毒的基因组结构，第三个是从多伦多分离出的SARS CoV Tor冠毒的基因组结构。它们的结构都很类似，它们的前面都有两个主开放阅读框（译者注：ORF, Open Reading Frames，指基因中具有编码蛋白潜能的序列) 。开放阅读框ORF Ia和Ib（棕色部分），这非结构大蛋白会被裂解为16个小蛋白，这些小蛋白与病毒的复制和寄主免疫反应有关。

结构蛋白包括4种（绿色部分）：纤突蛋白（S）、病毒包膜（E）、蛋白膜（M）和病毒核酸衣壳（N）（nucleocapsid），其中，S蛋白是与人体受体结合的蛋白，与受体的血管紧张素转换酶ACE2（Angiotensin-converting enzyme 2）进行结合。

绿色部分有几个特殊的ORF，编号从3-9：它们在不同的冠状病毒中不太一样，功能可能是对先天免疫响应的蛋白进行修饰。可见，通过改变寄主的免疫响应，冠状病毒家族可以变得非常容易进入人体细胞。

冠状病毒是如何进入人体的呢？

从图6可见，SARS病毒通过与受体ACE2的肽酶域（peptidase domain）结合而进入人体细胞。S蛋白和ACE2被跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2，见图中绿色部分）劈开（见图B，黄色为ACE2受体），形成一个楔口。这使得S蛋白结构发生改变（conformational change)），使得病毒的亚单位（subunit)楔入细胞膜的磷脂双分子层（Lipid bilayer)。所以如果能够阻断楔入发生，则能有效阻挡S蛋白进入细胞，但如果无法阻断楔入发生，则S蛋白便容易进入人体细胞。这个进入机制与流感很相似。

ACE2（血管紧张素转换酶2）的表达主要在肺上皮细胞和心、肾的血管内皮上。上帝给人类ACE2酶的目的是为了降血压。血管紧张素ACE将血管紧张素I型（Ang-I，或AT-I）劈开成为血管紧张素二型（Ang-II，或AT-II），形成较小的肽蛋白。而ACE2的功能是与ACE抗衡，可以阻止ACE产生更多的AT-II，因为过高的AT-II会导致血管收缩、肺水肿、高血管渗透性和急性呼吸窘迫综合症等。

用ACE抑制剂可以降低ACE水平，从而降低AT-II的产生（这种方法往往被用于治疗高血压），但它只影响ACE1受体，并不影响ACE2。它可能会导致肺部病变，例如支气管痉挛（ bronchoconstriction）

Figure6 病毒如何进入人体？

下面来看看新冠病毒与SARS-CoV的相似性和区别在哪里：

Figure 7 新冠病毒和其他病毒的比较

上图中，粉红曲线是蝙蝠病毒RaTG13，与新冠病毒的相似度为96% 相同。绿色曲线是穿山甲的冠状病毒，与新冠病毒的相似度为80%。可以看出，新冠病毒与蝙蝠冠状病毒RaTG13的关联最密切。

该研究目前进展迅速，有若干个机构在做，数据很新，上面的数据来自Duke大学，也就是过去两周出来的，它比较了新冠病毒和其它几种种相近冠状病毒的基因组的差异。新冠病毒与蝙蝠病毒有96% 相同，主要差异有三处，即开放阅读框ORF-1部分、S蛋白部分以及后面的ORF-8部分（这部分主管免疫响应）。这里的关键是S蛋白。

新冠病毒与原初的SARS-CoV相同度只有80%相似度，但与蝙蝠病毒RaTG13有96%的相似度。RaTG13是中国在大约12年前分离出来的，它与新冠病毒的主要差异在S蛋白部分（红色椭圆部分）。有意思的是在这个S蛋白区域，新冠病毒倒是与穿山甲病毒高度重合。可以看到，本来蝙蝠病毒的S蛋白与人体细胞膜并不结合，所以RaTG13并不能感染人体。

那么，为什么新冠病毒的传染性那么高呢？让我们来仔细对比一下几种冠状病毒的S蛋白区域下的亚单元结构，特别是其中受体结合域（RBD）的差异，见图8。

Figure 8 几种冠状病毒的S蛋白区域下的亚单元结构

本图来自Scripps Research的Kristian Andersen于今年3月17号发表在《自然医学》上的一篇论文。第一排是新冠病毒的核酸基因组排序，有将近3万个碱基对，其中棕色部分是S蛋白区。第二排是这个S蛋白的2个亚单元S1和S2。分析集中在受体结合域（RBD）部分 、切割区（位于S蛋白亚单元670-690之间）部分以及这个区域下的多碱基切割点部分。该论文分析了6种冠状病毒在这几个区域的异同。

这6种病毒中的第一个是新冠病毒，第二个是蝙蝠病毒RaTG13，第三个是穿山甲病毒，第四个是2003年的SARS-CoV病毒，第五和第六是两个与蝙蝠SARS-CoV相关的病毒。

如果你仔细观察，可以发现在S蛋白区域，穿山甲的基因序列替换了蝙蝠病毒RaTG13的这段序列，形成了新冠病毒。可以假设穿山甲的基因序列与蝙蝠的基因序列在这个区域发生了重组，目前正在流行的新冠病毒就是蝙蝠病毒RaTG13获得了穿山甲的这段S蛋白基因的结果。

与S蛋白的另一个差异位于切割区（位于S蛋白亚单元670-690之间），把S蛋白切割为S蛋白亚单元S1和S2。通过切割，可以将穿山甲的基因序列插入细胞膜。新冠的这部分碱基来源目前尚不清楚。其中的氨基酸排列使得这个切割点特别易于接受各种蛋白酶。这段序列在蝙蝠和穿山甲的相对位置并不存在。也就是说，新冠病毒在亚单元S1和S2之间获得了一种新型的弗林蛋白酶切割点位(novel furin cleavage site)。

我们上面提到穿山甲的S蛋白。这个穿山甲到底是什么玩意儿？

Figure 9 食蚁兽

维基对穿山甲的定义是这样描述的：“Pangolins, or scaly anteaters … which are used in Chinese traditional medicine for a variety of ailments including excessive anxiety and hysterical crying in children, women thought to be possessed by devils and ogres, malarial fever, and deafness”就是说，这是一种身披鳞甲的食蚁兽，传统中医用来治疗多种疾病如：焦虑、儿童歇斯底里哭叫、妇女被妖魔缠身以及疟疾发烧和聋哑。（不清楚为什么不用来治疗男人被妖魔缠身？哈哈！）

上面说过，新冠病毒是蝙蝠病毒和穿山甲病毒重组的结果。我们可以通过冷冻电镜来观察新冠病毒的S蛋白与人体受体ACE2的亲和情况。

最近在《科学》杂志上发表一篇关于新冠病毒S蛋白和ACE2受体亲和性的冷冻电镜结构，比较了新冠和SARS病毒的受体结合域（RBD）（图10）。可见，凡是用穿山甲病毒替代蝙蝠病毒的部分，S蛋白域和ACE2域均产生了紧密结合，大大提高或促进了两者间的亲和力，所提高的级别或许是对数级的，估计亲和力在纳米水平上。再加上前面提到的弗林蛋白切割位点，使得新冠病毒对人群具有非常高的传染性。这可以说是进化的奇迹，令人不可思议。

Figure 10 新冠病毒S蛋白和ACE2受体亲和性的冷冻电镜结构

下面我们再来看看新冠病毒的复制速度：

上面提到，对新冠病毒与SARS病毒在另外两个开放阅读区ORF8和ORF1a为什么有差异的原因还不清楚。我们对ORF8的功能还不完全清楚，但ORF1a可能与提高病毒复制速度有关，它可能会降低寄主自然免疫响应能力。尽管如此，我们可以知道的是，新冠病毒经过这些ORF的替换后会具有两个特点：一是能够容易进入寄主，二是能够快速复制，而且要比SARS快很多。

这一点从新冠流行之初就变得十分明显，当人们开始测试病毒核酸（RT-PCR，逆转录聚合酶链式反应） 。图11是最近中国人发表的第一篇论文，测量新冠病人鼻拭子的RT-PCR的Ct值（ cycle threshold 循环阈值，这个值越低说明目标核酸越高）所有这些病毒在感染的初期（第一周内）的Ct值都非常低，说明核酸水平很高，但是病人并无症状，然后病毒核酸逐渐减弱。

Figure11 新冠喉试子和鼻试子的Ct值

图12是17年前（2003年）对SARS病毒的测试情况，可以看到SARS的复制高峰出现于感染后的第10天，此时病人才开始出现症状。与图11比较，新冠病毒的浓度在无症状的早期反而较高。

Figure12 2003年14个萨斯病人鼻咽液体的RT-PCR测试

下面是一个德国慕尼黑9个病人的案例：虽然人数较少但分析的很详尽。这些病人都是轻症，而且明确知道何时从何处被感染，他们被感染方式都是一样的。

Figure13 拭子病毒释放的特点

图13是病人出现症状后咽拭子和鼻拭子的核酸数分布情况，下半部分是病人的唾液和粪便拭子的核酸数分布情况。重要的是要了解胃上皮细胞上也会有ACE2，所以病毒很可能也会在胃上皮细胞上复制。当然，这也许是直接吞食了别的病人唾液中病毒的结果。

从图中可见，病毒浓度在初期较高，随着时间呈下降趋势。本图是以对数来表达核酸反应的Ct值的，然后再转换为病毒浓毒值。病毒浓度大约是10^6 或10^8/mL。这个浓度其实和SARS差不多，所以新冠浓度并不比SARS高，只是比SARS来的快。

值得注意的是，在尿液和血液中并没有发现核酸。病毒脓毒起码得在10到6（见图13），才能从生物样品上分离出病毒颗粒（Virion来) 确定阳性。也就是说，只当核酸脓毒很高时，病毒才有活性。

这个案例还研究了拭子中的核酸水平与传染性的关联度，具体做法是测量培养组织中的病毒复制情况。无论是鼻拭子还是咽拭子，浓度最高之时就是培养组织呈阳性之时（见图14）。此后，虽然在鼻拭子、喉拭子、唾液或粪便中仍然可以测到核酸，但培养组织中不再呈阳性，也就是说不再具有传染性了。

Figure14 以对数表示的核算复制

图15是9个病人的病毒浓度曲线。这个图的绘制结合了血清转换点的位置，我后面讲抗体时再介绍。可见随着血清转换，病毒浓度开始减弱，但不是很快，有些人会拖很久，可能会长达22天，了解这点很重要。

Figure 15 9个病人的病毒载量、血清转换和临床观察

新冠病毒的传染性和致死率到底如何？我们来看下面这张图。

Figure 16 各类病毒的传染率和致死率关系

图16中Y轴是致死率，横轴是每个病人传染的人数（传染率 R0）。可见，左上角是一些致死率非常高的病毒，如禽流感和埃博拉病毒。这些病毒传染大约1-2人，而新冠的位置大约处于致死率0.7% 到3.4%，传染率大约1.5到3.5. 如果你和右下角的麻疹和水痘比较，它们传播的非常快，但致死率很低。

新冠病毒的潜伏期情况如何？通过这些研究你可以大致分析新冠的潜伏期，即从被感染到出现症状这段时间，这期间病人可能具有传染性。从图中可见，新冠的典型潜伏期约为5天，但也可能短到2天，长达12天。

Figure 17 新冠病毒与各种病毒潜伏期的比较

新冠在无症状人群中的传播：

从前面的分析可见，新冠病毒能在呼吸道上皮上快速复制，所以很容易由无症状者传播。它的传染率Ro 大约为2.5，即每个感染者平均会传给其它2.5个人。根据对一艘游轮上新冠病毒传播的分析来看，船上的无症状感染者的比例约为15%。（另外，我不明白为什么要去坐游轮，所有的传染科医生都会告诉你千万不要去游轮。）

图18来自Rothe在NEJM 2020年3月份发表的一篇论文：Transmission of 2019-nCoV Infection from an Asymptomatic Contact in Germany《 德国一例无症状感染者新冠肺炎传播研究》。

Figure18 德国零号病人接触传染史

上图中，零号病人（index patient）是一位到德国参加业务会议的中国妇女。图中列出了她的活动路线（从中国到德国）和到达德国之后的活动时间表和症状情况：1月19号到达，22号乘坐飞机返回中国，1月22号后出现症状，1月26号测出阳性。下面几行列出了其它4位与这位零号病人有过接触的活动情况和感染情况。其中病人1和2也参加了同一个会议，两人都在1月24号出现症状。病人1于1月27号测出阳性，病人2于1月28号测出阳性。病人1在20号和21号分别传染给病人3和4（见橘色的C）。用这样一种接触史记录方法可以让我们计算传播率Ro。

新冠是种经过高度进化并适应了人体的动物病毒

根据上面Rothe提供的论文分析，蝙蝠病毒有很多演化种类，许多烈性的病毒均来自蝙蝠。新冠病毒来自蝙蝠病毒，然后通过与穿山甲或其它什么动物的病毒进行重组而得到。它获得的S蛋白可以高效并快速楔入寄主体内，不仅与寄主的受体有高度亲和力，而且还可能调节寄主的天生免疫响应。它能够迅速大量复制，但致死率与其它病毒相比并算不太高。它相当稳定，可在肠胃道中复制并从粪便中检测到它的分泌物。

了解这篇论文的作者最近向NEJM提交了美国国家研究院（NIH）的一个小组的一份报告，他们培养了新冠病毒并在不同物体的表面测试病毒的稳定性，以了解该病毒在不同的环境中的存活时间。它的半衰期在塑料和钢铁上差不多是6个小时。如果你在这些物体表面放置10的6次方个病毒粒子，几天后你做核算检测，病毒粒子仍在10的2次方或3次方的水平。这个案例还测试了游轮回来22天后病毒残留在物体表面的情况。究竟检测到的是一种传染性的病毒还是非传染性的核酸是另一个问题，但可以说这个病毒非常稳定。

其结果是大自然制造了一个高度传染性的病毒，人真不应该去干预大自然的自然选择过程。当然所有这些论文对于病毒来源的观点是，该病毒属于自然进化而不是实验室中的人工设计。有很多谣言认为这是人造的病毒, 所有将该病毒的基因组序列与其它相关病毒的基因组序列进行过研究的人都得出结论说这是一个自然进化结果。

那么，究竟蝙蝠是怎么回事？

蝙蝠是许多人类病原体的来源，例如SARS、MERS、埃博拉病毒、马尔堡病毒、狂犬病、亨德拉病毒等，所有这些致命的病毒均来自蝙蝠，这到底是怎么回事？这些病毒会进入人体并造成严重感染，之后又让人体获得免疫。可是，对人类这么致命的病毒在蝙蝠体内为什么只会对其造成持续的轻度感染而不会让蝙蝠致病？

Figure19 蝙蝠病毒通过中间宿主感染人类

研究发现，蝙蝠的免疫系统是完全独特的一种免疫系统，它们的细胞受体是多态的（Polymorphic）。蝙蝠成为许多病毒的来源是有原因的。它之所以不会被感染的真正原因是它们有着非常强大的天生免疫系统，特别是能快速产生I型干扰素响应。有些蝙蝠品种可以持续地产生干扰素并对干扰素刺激产生的基因（ISGs，An interferon-stimulated genes）产生持续表达，它们除了能够表达α干扰素（IFNα）之外，还能够表达多种干扰素，而且不出现感染症状。

作为一种补偿，蝙蝠的免疫系统常常降低对其它受体的先天调节能力（如NALP3功能)，扩展了NK（Natural killer）抑制受体，通过减弱对DNA的探测功能，以此来建立一个稳定病毒容忍状态。许多人猜测，蝙蝠之所以有较高的容忍度是因为需要降低炎症反应，这样一种持续的携带病毒状态可以适应飞行时体内产生的新陈代谢压力。

但这一切是如何演化为人体病原体的呢？请注意今年二月份伯克利大学出了篇非常棒的论文对此进行了研究（该论文是去年5月份提交的，所以与新冠无关）。他们解释了为什么蝙蝠病毒成了所有这些恶性病毒的来源。他们对普通非洲猴子的肾细胞系(Vero cells）和两种蝙蝠的细胞系（其中一种会持续地产生α干扰素）进行组织培养并对其进行三种病毒感染（VSV-G，rVSV-EBOV和rVSV-MARV)），然后观察这些病毒在三种细胞组织培养中的实时扩散情况。研究发现蝙蝠对多种病毒都有抵抗能力。

蝙蝠细胞加速病毒演化

伯克利大学的这篇论文十分优秀，它含有大量数据和数学模型（右下图）。顺便说，生物学论文一旦有大量数学，我总是会被吓着。

Figure20 Vero细胞受到几种病毒感染存活比例的时间序列分析

从图中看，蝙蝠对rVSV-EBOV病毒和rVSV-MARV病毒均有抵抗性。虽然可以找到病毒残余，但许多细胞并未受到感染。看图中第一行，病毒大量复制，肾细胞（Vero cells，亦称非洲绿猴肾细胞）对病毒毫无无抵抗性，被彻底杀死，这样病毒也就消失了。对于第三行的细胞系，因为有α干扰素的持续产生，压制了病毒复制水平，虽然病毒仍然一直残留在细胞组织中。

蝙蝠的强抗病毒免疫能力让病毒在初期快速复制并产生持久的炎症。似乎蝙蝠超强的病毒免疫能力加速了病毒的变异，这虽然可以帮助蝙蝠避免炎症反应，但对人体是有害的。蝙蝠病毒的情况大致就是如此。