• 11月01日 星期五

ACS Sustain. Chem. Eng.|甘蔗渣生产L-酪氨酸的集成工艺
























大家好,今天推送的文章来自于发表在ACS Sustainable Chemistry&Engineering.上,的“An Integrated Process for L‑Tyrosine Production from Sugarcane Bagasse”,通讯作者为新加坡国立大学的颜宁教授

氨基酸是蛋白质的组成部分。它们对所有生物生命形式都是必不可少的,对我们的饮食也是不可或缺的。在当今的食品工业中,氨基酸被广泛用做制造食品添加剂的前体,包括增味剂如L-谷氨酸钠(MSG)和人工甜味剂阿斯巴甜。氨基酸也定期添加到动物饲料中,以满足各种牲畜的营养需求。此外,氨基酸作为补充剂或用于治疗某些疾病,如苯丙酮尿症(PKU)。

氨基酸的可持续生产正成为食品安全的一个重要组成部分,因为它有助于稳定食品供应。如最近的大流行所强调的那样传统上,许多氨基酸是由微生物如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌生产的,通常使用葡萄糖作为原料。近年来,非食用木质纤维素生物质的微生物发酵也被积极探索用于氨基酸的生产。利用木质纤维素生物质生产氨基酸有助于保存可食用的糖如葡萄糖,并允许从农业过程中产生的废物循环,否则处理这些废物的成本可能很高。这些过程通常包括原始生物质的酸性预处理、去除生长抑制剂的生物解毒以及释放游离糖用于发酵的酶水解。例如,可以使用谷氨酸棒状杆菌SIIM B253,从玉米秸秆生产L-赖氨酸,而谷氨酸棒状杆菌的工程菌株可以从小麦秸秆生产高纯度的L-谷氨酸。

木质纤维素的组成分为三种主要结构聚合物:纤维素、半纤维素和木质素。纤维素和半纤维素可以通过化学或酶水解水解成各种可发酵的C6糖和C5糖,而木质素的成分通常不被大多数常规微生物利用。然而,作者看到了从木质素中的对香豆酸(pCA)含量生产L-酪氨酸的独特机会。

在植物中,pCA来源于L-酪氨酸,或来自肉桂酸的氧化,被转化为构成木质素核心聚合物的各种苯丙素单元。少量的pCA和FA也通过酯化作用与木质素核心聚合物连接,并且它们可以通过碱性水解从木质素中解离。木质素衍生的pCA可以被腐生细菌利用来生产各种工业相关的化合物,例如粘稠物酸、聚羟基烷酸酯。理论上,pCA经过碱处理的生物质材料可以很容易地被水解酶消化成游离糖,可以通过微生物发酵转化成左旋酪氨酸。当结合使用时,这两个平行的过程(五氯苯甲醚胺化和微生物发酵)可以成为将木质纤维素废物升级为左旋酪氨酸的有效策略。

甘蔗渣是巴西、印度和中国等高糖生产率国家常见的农业残渣。其作为木质纤维素原料用于微生物发酵已有大量报道,包括乙醇、叶醇、和乳酸在内的多种产品已被证实。由于其丰度高、成本低、pCA含量丰富,作者以甘蔗渣为模型木质纤维素底物。作者优化了甘蔗渣的碱水解处理以高效脱木素和回收pCA,并开发了全细胞生物转化工艺以将木质素衍生的pCA转化为L-酪氨酸。与此同时,碱处理的甘蔗渣残渣被用于一锅酶消化和大肠杆菌发酵过程,以生产L-酪氨酸。从生甘蔗渣中生产左旋酪氨酸的两种途径对最终左旋酪氨酸产量的贡献几乎相等,为49毫克/克。与单独使用发酵过程相比,生物转化过程的整合有效地使左旋酪氨酸的产量增加了一倍。该集成工艺还允许从木质纤维素生物质的不同组分生产作为均匀产品的左旋酪氨酸,简化了下游纯化并最小化了工艺成本。作者认为,这些都是有助于从木质纤维素材料中更有利可图和可持续生产左旋酪氨酸的重要因素。

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作者第一步先对甘蔗渣进行了碱性水解,以促进生物质生产五氯苯甲醚。作者首先研究了在生物量负载为0.02克/毫升、持续时间为1小时的情况下,碱浓度(0-2mol)对五氯苯甲醚提取的影响。产物产率与0-1.5米范围内的氢氧化钠浓度呈正相关。考虑到高碱浓度会对后续生物转化过程产生负面影响,并且不利于过程的可持续性,作者在后续实验中选择了0.5mol氢氧化钠。时间进程分析显示五氯苯甲醚的产量持续增加即使在水解8小时后,尽管速率较低。为了使水解液中的五氯苯甲醚浓度最大化,采用不同的固液比(水解时间固定在10小时)对甘蔗渣进行碱性水解。当S/L从0.02增加到0.05克/毫升时,五氯苯甲醚的产量保持不变,而五氯苯甲醚的浓度几乎增加了一倍。然而,0.05克/毫升的反应混合物形成了粘性半固体基质,这阻碍了传质效率,并增加了产品下游加工的复杂性。因此,本研究的其余部分采用了0.033克/毫升的S/L。在最佳条件下,1克甘蔗渣的碱性水解产生44.3毫克的五氯苯甲醚。

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随后作者进行元素分析以进一步监测甘蔗渣的组成变化,其显示出在碱性水解后氧/碳比(从0.81到0.95)和氢/碳比(从1.62到1.74)的适度增加,这与由于脱木素作用导致的芳香族成分的损失一致。从以上讨论可以推断,碱水解有效地溶解了木质素,并从甘蔗渣中释放出五氯苯甲醚,用于随后通过胺化作用生产酪氨酸。该方法还保留了固体残渣中的大部分木聚糖部分和几乎所有纤维素,固体残渣也可以通过酶水解和微生物发酵转化为L-酪氨酸。根据总有机碳(TOC)分析结果,在该碱性水解步骤中几乎实现了100%的碳平衡。

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随后作者对香豆酸转化为左旋酪氨酸的进行全细胞生物转化,在确认从甘蔗渣中释放出五氯苯甲醚后,作者继续开发将五氯苯甲醚转化为L-酪氨酸的工艺。芳香族氨裂解酶如苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)和酪氨酸氨裂解酶(TAL)催化氨基酸可逆脱氨基成它们各自的芳基丙烯酸。作者首先尝试了使用来自变异鱼腥藻(AvPAL)的PAL的生物转化,最近显示其催化3-羟基肉桂酸acida结构的胺化,与pCA高度相似,转化率高达50%。生物转化在30℃下进行24 h,用高效液相色谱法分析生物转化前后的含量。虽然作者能够通过将肉桂酸转化为L-苯丙氨酸来证实AvPAL的活性,但是作者没有观察到对pCA的任何活性。

缺乏活性的一种解释可能是AvPAL对pCA的结合亲和力差。AvPAL的底物特异性由一对选择性残基Phe107和Leu108决定。AvPAL的底物结合结构表明,这两个残基的脂肪族和芳香族侧链位于肉桂酸苯环的正对面,这可能有助于稳定的疏水相互作用。同样,与pCA的对羟基的相互作用可能不被这些残基所青睐,导致pCA与AvPAL的结合亲和力较差。为了验证这一假设,作者将AvPAL的选择性残基改为可能有利于与pCA相互作用的残基。AvPAL的两个双取代突变体是通过定点诱变产生的:AvPAL F107Y-L108H和AvPAL F107Y-L108S,这两个突变体的选择性残基都被具有侧链的残基取代,侧链可以促进与pCA的对羟基的氢键结合。用这两种突变体进行的全细胞生物转化显示出对五氯苯甲醚胺化的一些活性(转化率分别为13%和6%),但效率仍然较低。

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PAL/TAL活性的另一个关键决定因素是反应条件的酸碱度。先前的一项研究报告了各种活性物质的最佳酸碱度范围为9至10.5,而SeTAL的最佳酸碱度为10.5。作者对酸碱度范围为7.5至10的五氯苯甲醚全细胞生物转化进行了类似的酸碱度优化。有趣的是,作者发现在pH 8.5时,五氯苯甲醚转化为左旋酪氨酸的转化率最高,45%的五氯苯甲醚被SeTAL转化为左旋酪氨酸。作者还观察到,使用左旋酪氨酸作为起始底物,在8.5-9.5的酸碱度范围内达到不同的平衡状态,而在8的酸碱度下,生物转化没有达到平衡。该结果表明可逆TAL反应的平衡状态也是反应pH的函数,但是它可能与酶活性的最佳pH不相关。发现将pCA转化为l-酪氨酸的最佳ph(ph 8.5)比报道的TAL活性的最佳ph(ph 10.5)低得多。

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接下来,作者测试了全细胞生物转化将甘蔗渣来源的五氯苯甲醚转化为左旋酪氨酸的有效性。碱性水解产物甘蔗渣的水解物冷冻干燥,然后在优化的生物转化溶液(5 mol氨,pH 8.5)中重构至初始pCA浓度为5 mM。表达SeTAL的大肠杆菌全细胞以10 g/L的干细胞重量重悬于溶液中,开始生物转化过程。48小时后,L-酪氨酸转化率为49%,类似于商用五氯苯甲醚的全细胞生物转化。这表明甘蔗渣水解物可直接用于全细胞生物转化过程,将五氯苯甲醚组分胺化为左旋酪氨酸。由于每克甘蔗渣水解可释放出44.3毫克的五氯苯甲醚,因此随后可产生23.8毫克的酪氨酸,摩尔转化率为49%。该方法代表了从木质纤维素生物质生产左旋酪氨酸的额外途径,其与常规微生物发酵平行工作以增加总左旋酪氨酸产量。

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木质纤维素生物质中对香豆酸(pCA)的存在为生产L-酪氨酸提供了独特的机会,L-酪氨酸是食品工业中使用的一种重要氨基酸。总的来说,这两种方法的L-酪氨酸总产率为49毫克/克,每种方法占总产率的大约一半。应该注意的是,发酵过程中的左旋酪氨酸产量可以通过进一步的菌株优化来提高,例如表达莽草酸途径的额外基因,并能够共同利用R-葡萄糖和R-木糖。尽管如此,通过五氯苯甲醚胺化产生的额外L-酪氨酸仍将占总L-酪氨酸产量的很大一部分,应该在木质纤维素生物质利用的未来发展中加以考虑。






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整理:张经纬

文章信息:

DOI10.1021/acssuschemeng.1c03098

文章链接

:https://doi.org/10.1021/acssuschemeng.1c03098


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