前沿技术分享——用于及时诊断的荧光微球（上篇）

今天给大家介绍一篇来自新加坡国立大学的张勇教授的研究工作，新加坡国立大学生物医药工程学院张勇教授团队多年来致力于纳米荧光材料制备和应用研究，主要研究方向为纳米荧光材料的可控制备、表面改性和功能化，这篇综述主要围绕了荧光编码微球的制备方法、荧光编码微球的主要生化应用（核酸、蛋白质以及CTC检测）、基于智能手机或者可折叠微流控芯片的POCT的应用以及主要问题和未来的展望等四大板块内容进行阐述。

【背景介绍】

荧光编码微球具有优良的比表面积，提供了更加灵敏的检测，同时荧光编码微球具有编码以及解码过程简单，编码容量大以及可大批量制备等优势。荧光编码微球一般利用荧光的发射波长以及强度进行编码。荧光编码微球的编码元件包括半导体的量子点、有机荧光染料以及上转换纳米颗粒等主要编码元件。

半导体的量子点的发射光谱窄，荧光稳定性好，较宽的的激发光谱可以实现多种量子点的单一波长激发。有机荧光染料价格低廉、种类较多，适用于多种编码方法以及多种材质的微球，不同批次间的荧光均一性较好。上转换纳米颗粒利用近红外发激光，可以避免生物分子背景荧光的干扰，另外可以避免不同发射波长间的共振能量转移现象。

【荧光编码微球的制备方法】

有机溶剂溶胀法：聚合物微球在有机溶剂中溶胀，染料或者量子点等渗入微球内部，移除有机溶剂之后，微球的聚合物网络发生收缩，并将染料或者量子点包裹在微球内部，关键点：调整染料或者量子点的种类或者浓度可以实现不同的荧光编码。

方法改进：利用有机溶剂溶胀-溶剂蒸发法，利用量子点以及微球的氯仿溶液在密封条件下搅拌2h溶胀微球，之后将溶液在空气氛围下搅拌2h，随着氯仿的挥发，溶液中的量子点的浓度逐步升高，促使量子点渗入微球内部，该方法可以提高荧光编码微球的荧光稳定性以及均一性。

利用该方法最典型的的商业产品就是Luminex公司的microPlex微球，主要就是利用红色以及近红外两种染料对聚苯乙烯微球进行编码，两种染料可以分别设定10个浓度梯度，得到100种荧光编码微球，并开发了对应xMAP多重样本分析平台，该方法增加了包裹的效率以及量子点分布的均一性。

荧光编码微球第二种主流制备方法是层层的自组装法（表面交联法/利用疏水作用的结合）。

层层自组装法：利用聚电解质以及相反电性量子点之间的静电吸附作用，可以实现聚电解质以及量子点在微球表面的交替结合。调整聚电解质以及量子点结合的层数，可以控制微球表面负载的量子点的数量。

表面交联法：为了实现微球表面的固相引物的合成，Nanthakumar等利用高度交联，非溶胀的聚苯乙烯微球，通过在微球表面共价交联BODIPY染料分子，实现荧光编码寡核苷酸合成载体的制备。微球表面交联的染料数量由染料的浓度而定，利用浓度逐级稀释（10倍）的染料溶液，得到四种强度的荧光编码。

疏水作用结合：Hu等利用利用疏水作用的方法制备了量子点掺杂的介孔二氧化硅微球，利用该方法制备的量子点掺杂的介孔二氧化硅微球，编码微球表面结合聚乙二醇后包裹二氧化硅壳层。二氧化硅包裹后的荧光微球具有非常高的稳定性，避免溶剂中的量子点泄露以及化学诱导的荧光。

荧光编码微球还有通过包埋法来进行制备的，比如利用有机染料来进行编码，有机染料编码：Zhang利用单分散聚苯乙烯微球进行种子聚合，罗丹明6G（R6G）染料在聚合过程中被包埋在壳层内，调整染料的浓度可以准确控制微球的荧光强度，制备了12种不同荧光强度的荧光编码微球。Liu制备了烯丙基化的罗丹明B、荧光素以及尼罗红，将染料与聚苯乙烯的单体混合，通过分散聚合制备了三种荧光编码的微球，染料分子共聚在微球内部。有机溶胶-凝胶法（三聚氰胺–甲醛树脂微球），染料分子首先与树枝状的三聚氰胺-甲醛预聚物的分子结合，在预聚物进一步生成微球的同时，将染料分子包裹在微球内部。该方法对多种染料都有很高的包裹率，微球具有较高的热以及机械的稳定性，保存过程中几乎无染料的泄露。

量子点编码的方法：Yang等利用可聚合的表面活性剂作为乳化剂以及相转移剂，通过改进的细乳液聚合，将3-巯基丙酸修饰的CdTe量子点均匀包裹在聚苯乙烯微球内部。聚苯乙烯具有致密结构以及疏水特性，使得微球的荧光几乎不受到ph的影响。Graf的将聚乙烯吡咯烷酮修饰的量子点吸附到氨基功能化的二氧化硅微球的表面，在微球表面包裹二氧化壳层，将量子点固定在微球内部。Vaidya等在悬浮聚合过程中，将量子点包裹在聚乙烯微球内部，调整量子点的颜色以及数量实现了荧光编码微球的制备。（激光共聚焦显微镜分析证明，量子点在微球内部呈现多个团聚体分布，微球的发射光谱与非聚集态的量子点相比没有发生位移。）

刺激响应性的水凝胶的方法：Kuang课题组利用N-异丙基丙烯酰胺与4-乙烯基吡啶共聚物（PNIPVP）水凝胶的pH响应性，在酸性的条件下将溶胀的凝胶微球与水溶性的量子点进行共孵育，微球离心分散在ph=7的水溶液中，凝胶网络收缩将量子点包裹在微球内部，量子点在微球内均匀分布，将不同种类的量子点按照不同比例包裹在凝胶微球内，可以获得不同荧光编码的凝胶微球。

微流控技术法来制备荧光编码微球：Gerver课题组利用了全自动的微流控器件，制备了镧系的纳米荧光材料编码的亲水性聚合物微球。水系的纳米荧光材料、聚乙二醇双丙烯酸甲酯以及光引发剂等溶剂在甲醇中作为分散相，在流体通道中生成液滴，再经紫外线照射引发液滴内聚合反应，就得到荧光编码微球。Ji等利用微流控技术，制备了量子点编码的海藻酸钙微球，含有量子点、海藻酸钠的液滴与连续流动相中的钙离子作用，生成了包裹量子点的海藻酸钙凝胶微球。利用金字塔状的微流体网络可以实现量子点逐级浓度梯度的自动化。

最后总结下荧光编码微球制备方法的主要优点以及不足之处，如下表所示。

【荧光编码微球的主要生化应用】

荧光微球的生化检测主要利用两种方式，一种为悬浮芯片技术，另外一种方式基于微流控的技术或者微井阵列的方式。

悬浮芯片的原理如下图（悬浮芯片的检测原理示意图）所示：编码微球作为免疫检测的载体，所携带的编码信息同时用作表面结合探针分子的标记。该芯片的分析过程为目目标分子先与编码微球表面负载的探针分子结合，再进一步与带有荧光标记的报告分子结合，形成夹心式结构的复合体，微球带有的编码信息用于区分目标分子的种类，而报告分子的信号强弱则反映目标分子的含量。

Simoa技术将约250,000个捕获抗体包被在2.7μm的小磁珠上，检测时加入生物素标记的检测抗体及亲和素偶联的酶和底物，通过一层油将单个磁珠分别封闭在238,000个4.5μm的反应孔（Well）中进行反应。由于每个小孔的反应体系仅仅为50飞升，比传统ELISA小20亿倍，这时小孔中即使只有一个分子，其催化底物就可产生3000个荧光分子，通过CCD摄像头即可捕获到信号，利用泊松分布理论可计算出阳性荧光小孔（OnWell）对应的蛋白浓度值，实现数字化单分子检测的愿望。