“
榴莲（学名：Durio zibethinus Murr ），是一种巨型的热带常绿乔木，叶片长圆，顶端较尖，聚伞花序，花色淡黄，果实足球大小，果皮坚实，密生三角形刺，果肉是由假种皮的肉包组成，肉色淡黄，粘性多汁，是一种极具经济价值的水果。榴莲是热带著名水果之一，被誉为“水果之王”，在马来西亚，印度尼西亚，越南种植较多， 中国广东﹑海南也有种植，喜欢它的人嗜之如命，不喜欢的人避之不及.......小编属于前者，所以标题写上“香味”……
近日，由新加坡国立大学和新加坡基因组研究中心等单位合作研究，对榴莲基因组进行de novo测序并揭示其特殊香味儿的分子机制，相关研究结果发表在Nature genetics上。
”
01
材料和方法
材料：Musang King榴莲品种作为基因组组装材料，Monthong 和 Puang Manee作为比较转录组研究材料。3种榴莲品种不同的组织器官的转录组测序，Musang King果实成熟4个发育时期转录组测序。
方法和思路：纯三代+CHiCAGO+Hi-C完成de novo组装。3个锦葵目和6个双子叶物种作为比较基因组学分析的基因组，水稻作为外群。不同物种进行比较转录组分析，不同发育时期的果实进行转录组和代谢产物测定分析榴莲香味儿的相关基因家族以及和乙烯等等物质之间的关系。
02
结果与分析
2.1 组装与注释
调研图结果表明榴莲基因组大小为738Mb（流式细胞仪评估基因组大小为800Mb），杂合度为1%。利用PacBio纯三代测序，深度为153X（183Gb数据量），FALCON进行de novo组装，利用CHiCAGO技术将组装成的contig连接成scaffold，scaffold N50位22.7Mb，利用Hi-C技术将scaffold挂载到染色体水平，最终将榴莲基因组组装成30条pseudomolecules（染色体），挂载率为95%。
通过联合从头注释和转录组数据注释共发现榴莲含有45,335个基因models，其中42,747个基因可以被同源或者已知蛋白数据所支持。编码区平均长度为1.7Kb，平均包含5.8个外显子。GO注释到35,975个基因models，多数基因models富集到防御相应、果实发育、碳水化合物和脂质代谢通路中。利用BUSCO中陆生植物核心基因数据评估基因预测的准确性和完整度。榴莲中包含了90.3%的保守的核心基因，其中68.1%为单拷贝，22.2%为双拷贝。双拷贝的保守基因暗示榴莲在进化过程中经历了一次全基因组复制事件（WGD）。
2.2 比较基因组学分析
选择了3个锦葵目（雷蒙德氏棉，可可，树棉）和6个双子叶物种（拟南芥，白杨，大豆，葡萄，咖啡，番木瓜）作为比较基因组学分析的基因组，水稻作为外群。利用OrthoMCL聚类分析，共鉴定到32,159个基因家族，其中607个基因家族为榴莲独有。
基于47个单拷贝的直系同源基因，利用BEAST2软件中的贝叶斯算法构建了这11个物种的系统发育树。发现可可在62-85百万年前最先从共同祖先中分化出来，之后的60-77百万年前分化出榴莲，其他的物种分化均与前人研究结论一致。同源片段和Ks分析表明榴莲和雷蒙德氏棉共同发生了一次近代的全基因组加倍事件。
MGL类型基因家族在含硫化合物生物合成中起主要作用且在榴莲基因组中产生了扩张，基于此类基因家族对以上11个物种进行进化树分析，鉴定到了该基因家族的两个亚家族。其中一个非常保守的亚家族MGLa（来源于单拷贝可可和棉花，双拷贝于榴莲）代表着来源于祖先的亚家族。另一个在榴莲中的亚家族MGLb则由于基因组加倍事件产生。通过RNA-seq继续深入研究MGL亚家族基因在榴莲中的表达模式，发现MGLb亚家族的基因在榴莲果实中急剧上调表达，而MGLa亚家族基因则在果实中下调。这些结果暗示MGLb亚家族基因在榴莲果实中进化出新的功能。
2.3 比较转录组分析
分为三个层次进行：
1.3种不同榴莲品种的果皮，根系、茎、叶片转录组；
2.比较以上3中榴莲品种和其他物种（香蕉，芒果，鳄梨，番茄，草莓）转录组；
3.比较以上3种不同榴莲的果实转录组。每个样品3个生物学重复。基因集合富集分析表明榴莲中非果实部位上调的基因和细胞通路，比如硫化物代谢，果实成熟和味道物质相关的过程中。其中硫化物代谢相关的基因集合可以聚成五类，其中硫醇酸连接酶和蛋氨酸代谢途径（含MGL基因家族基因）中含有的上调基因最多。和其他物种相比，榴莲中硫化物代谢、脂肪氧化代谢通路、乙烯介导的果实成熟pathway和蛋白降解相关基因上调，其他代谢通路基因则下调。这些结果暗示榴莲中硫化物代谢和乙烯介导的果实成熟过程能被强烈地诱导，即便同其他的气候条件下生长的果实相比。
2.4 挥发性硫化物和果实成熟之间的潜在关系
根据以上的分析得到的结论，基于蛋氨酸合成通路的结果表明榴莲气味和果实成熟相关。而乙烯介导的果实成熟机制中恰好有蛋氨酸的参与。因此，作者设计了果实四个不同发育时期（开花后1个月，开花后2个月，开花后2.5个月，完全成熟后3天）的转录组测序和乙烯，挥发性硫化物测定试验，并利用qRT-PCR进行验证。结果表明转录组中和挥发性硫化物代谢相关基因与相关代谢产物之间的变化趋势一致。MGL，DEDs和乙烯相关基因（家族）在成熟后的果实中仍然高表达。总之，本研究结果表明榴莲的复杂香气可能与榴莲果实成熟有关，乙烯和VSC产生都与相同的调控过程和代谢物相关联。但是目前的研究，MGL表达，VSC生成和乙烯产生的的潜在联系仍需要进一步的功能实验来验证。
小编评价
本文的亮点在于利用纯三代组装的技术+CHiCAGO+Hi-C组装出高质量的榴莲参考基因组，并综合利用转录组+代谢产物分析的方法解释榴莲香气的可能分子机制，将基因组---转录组---代谢组结合起来，打通了结构基因组+比较基因组+功能基因组研究的链条，对后续的基因组研究，尤其是涉及物种特异的次级代谢产物（比如中药类物种）功能分析具有指导意义。
参考文献
Bin T T., Kevin L., Chern H Y., et al. The draft genome of tropical fruit durian (Durio zibethinus). 2017. Nature Genetics, doi:10.1038/ng.3972.