原木
在平房，科学家们将他们的研究从中马战俘营的三种病菌扩展到其他有可能被武器化的致命病菌，包括霍乱、伤寒和气肿疽。他们将这些病菌进行大规模产生。病原体在数千个果冻状的培养板上生长;在高峰期，一个月可以产生数百公斤病菌。他们在装着老鼠和稻壳的大型金属容器里饲养跳蚤;平房估计有4000个这样的金属容器，每月产生数百万只跳蚤。
从军事角度来看，生物武器最大的困难之一是如何将它们投送到目标---例如，如果通过轰炸，病原体在感染受害人之前就已经烧掉了。为了解决这个问题，日本科学家试验用玻璃和陶瓷制作炸弹，这些炸弹爆炸后会变成沾染了病菌的弹片。在实验过程中，这些炸弹装满了跳蚤，扔到被捕蝇纸包围着的目标上;然后，科学家每隔一段距离计算离爆炸点跳蚤的数量。此外，日本科学家为飞机配备了低空喷洒生物武器的设备，并使数百只马和羊感染了炭疽杆菌。
人体实验包括将人绑在与炸弹一定距离的木桩上，以研究他们如何感染炭疽和气肿疽等病菌。他们还发给犯人掺了伤寒和鼠疫病菌的牛奶、巧克力和甜瓜。犯人感染后，实验对象被活体解剖，而且没有麻醉，因为医生担心这会让他们的数据不准。
在满洲，日本研究人员还用大久野岛生产的化学武器进行人体实验。例如，在1940年的户外实验中，数百枚芥子剂炮弹射向一群中国囚犯，以确定不同类型的掩体和防护装备的有效性。其他的“原木”则被强迫喝下黄剂，而且滴进囚犯的眼睛里。平房还有一个房间，在那里，犯人（包括至少一位母亲和孩子在内）被用氰化氢毒气毒死。当日本人在中国进行此类实验时，在世界另一端，纳粹用齐克隆-B(Zyklon-B)包装的氰化氢杀害了数百万犹太人、吉普赛人和政敌。
毫无疑问，日本政府高层知道731部队的试验，天皇的弟弟三笠亲王（Prince Mikasa）在回忆录中说，他观看过中国囚犯“被带到满洲平原上进行人体毒气实验”的电影。
除了中国，日本科学家还在新加坡开展研究，他们在那里饲养携带黑死病病菌的老鼠和跳蚤;在菲律宾，他们用战俘进行截肢和解剖实验。与此同时，1945年5月和6月，在九州的帝国大学(Kyushu Imperial University)，一些医疗队（与731部队无关）对8名美国战俘进行了活体实验，包括切除他们的肺部、注射海水以及在他们的头上钻孔。
战场上的生物武器
日军到底在多大范围使用了生物武器，目前仍存在广泛的争论。例如，在战后，石井声称只有12起，但今天大多数专家认为这个数字要高得多。
1939年，日本将第一批生物武器部署在苏联-满洲边境。据前731部队成员透露，日军将伤寒以及其他病菌倒入诺门坎河（Khalkin-Gol River），希望能感染驻扎在下游的俄军。其后果没人知道，但在行动后，石井的部队得到了表彰，这表明他的上级对结果感到满意。45在整个1939年和1940年，日军持续用伤寒菌进行实地试验，他们向哈尔滨地区大约1000口井投了毒。
第二年10月，浙江省发生了两起有详细记录的生化攻击，日本飞机在宁波市和衢县上空投撒粮食和跳蚤。据《中华医学杂志》报道，投放小麦可能是为了吸引当地的鼠群，然后鼠群就会被跳蚤感染。后来鼠疫在该地区蔓延。据报告，有120人死亡;而这一地区以前从未爆发过这种疾病。1941年在常德也发生过类似的生化攻击，日军在常德投放了36公斤携带鼠疫的跳蚤，引发了一场瘟疫，造成7643人死亡。
1942年4月，美军开始对日本发动空袭。这就是所谓的“杜利德空袭”，18架美国轰炸机从太平洋的军舰上起飞，轰炸了东京地区，然后降落在中国，在那里，机组人员得到了中国老百姓和军队的帮助。东京轰炸和中国当地的援助激怒了日军，作为报复，他们屠杀了25万中国人。除了常规武器，日军还使用了生物武器，他们向水井和水库投放霍乱、伤寒和鼠疫病菌。其中一些生物攻击适得其反，感染了日军自己，导致1700人死亡。
1942年，日本的生物武器造成的霍乱疫情在云南和山东蔓延，40万人死亡。在其他一些地方，日本飞机投放带有炭疽菌的羽毛，军队留下沾染了鼠疫的钢笔和手杖，发放带有伤寒菌的面包。许多这样的行动都是为了给日本的焦土政策提供合法性---当疫情爆发时，日军会以控制疾病为借口烧掉村庄。
在战争、大规模流离失所和饥荒的背景下，很难准确地查明生物武器的受害人数。美国历史学家谢尔登·H·哈里斯(Sheldon H. Harris)估计受害人数在“六位数左右”，中国专家估计总数为58万。另一方面，日本731部队的首席研究人员津内幸一（Tsuneishi Keiichi）承认日军投放了生物武器，但他认为没有证据表明是由于日本使用了生物武器而引发了大规模瘟疫。
同样有争议的是，日本生物武器试验的受害者是否包括盟军人员。毫无疑问，俄罗斯战俘接受了实验，九州大学(Kyushu University)曾对八名战俘进行解剖，但美国战俘认为，他们曾在奉天战俘营被用于人体试验。美国政府称，目前还没有找到确凿的证据。
另一方面，日军至少用了三种方法来使用生物武器来对付美军和美国老百姓。1944年，在塞班战役(Battle of Saipan)期间，日军科学家携带一船了感染了鼠疫病菌的跳蚤来到塞班岛，准备布撒在岛上的滩涂，但他们的船在到达之前就被美军潜艇击沉。第二项计划是将大久野岛以及其他地方的儿童制作的纸气球装上生物武器，通过太平洋湾流将生物武器带进美国。根据日本科学家的说法，他们进行了多次试验，但最终认为气球“不能完成这个任务”。相反，日军在气球上装载了常规炸弹，放飞了6000个这样的气球。大约200个气球抵达美国，造成至少7人死亡。为避免造成社会恐慌，美国当局封锁了气球袭击的新闻。最后一个生化武器计划代号为“夜晚的樱花”：日本飞机在圣地亚哥上空投放感染了鼠疫病菌的跳蚤。他们预定1945年9月实施，但还没付诸行动战争就结束了。